SDS-PAGE是十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成。其中四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂能催化过硫酸铵产生自由基。过硫酸铵（APS）作为催化剂产生自由基，从而引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
其中SDS（十二烷基硫酸钠）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。之所以会有分离胶和浓缩胶之分，浓缩胶和分离胶的PH值不同，前者主要表现为浓缩效用，后者表现为分子筛效用。浓缩胶的pH是6.8，在这个pH条件下，缓冲液中的HCl的Cl离子几乎全部解离，Gly的等电点为6.0，仅少数解离为负离子，在电场中移动速度很慢。酸性蛋白质在此pH下解离为负离子，三类离子的迁移速率为Cl>一般蛋白质>Gly，电泳开始后，Cl离子泳动快，在其后留下一个低离子浓度区。Gly在电场中移动很慢，造成移动离子的缺乏，于是快慢离子间就形成了一个缺少离子的高压区，在高压区内所有的负离子都会加速移动，当移到Cl离子区域时，高电压消失，蛋白质的移动速度慢下来，当以上稳定状态建立后，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层，按照电荷大小排列，但是由于目标蛋白都带有负电荷，所以位于同一的起点。从浓缩胶进入分离胶后，胶的pH升高，Gly的离解度增大，泳动率上升，又因为它分子小，故超过所有的蛋白质分子，紧跟在Cl离子后，Cl离子迁移后，低离子浓度不再存在，形成了恒定的电场强度，因此，蛋白质样品在分离胶中的分离主要取决于它的电荷性质，分子大小和形状，分离胶的孔径有一定大小，对不同相对质量的蛋白质来说，通过时收到的滞阻作用不同，即使静电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。
步骤：
1.配胶，有分离胶和浓缩胶之分，胶浓度随你蛋白的大小变化而变化，一般12%，一般需要两个小时，需要提前准备。短期可以充水放置于4℃冰箱。
2.将蛋白加入5X的SDS-loading， 100℃加热10min，以充分变性蛋白。
3.上样，一般10μL。
4.浓缩胶一般80V 30min 进入分离胶后可140V 30min。
5.结束后可用于考染或者western blot。
最后的最后? 提醒一下自己：
丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺（Arc-Bis）：中等毒性，神经毒剂。低浓度接触数月数年后，渐出现头痛头晕疲劳，嗜睡，手指剌痛，麻木感，常伴有两手掌发红，脱屑，手掌足心多汗。
过硫酸铵（APS）：对皮肤粘膜有刺激性和腐蚀性.吸入后引起鼻炎、喉炎、气短和咳嗽等.眼、皮肤接触可引起强烈刺激、疼痛甚至灼伤.口服引起腹痛、恶心和呕吐.长期皮肤接触可引起变应性皮炎.。
SDS：对粘膜和上呼吸道有刺激作用,对眼和皮肤有刺激作用.可引起呼吸系统过敏性反应。
TEMED：强神经毒剂
记得带上手套和口罩！
SDS-PAGE电泳求助专题
因为因素都是有条件的，影响泳动速度的有好几个因素，有的因素作用力大，有的因素作用力小。
因素有:1、 首先决定于带颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状。一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则慢。泳动度还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，泳动度与颗表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径反比。带电荷的高分子在电解质溶液中把一些带有相反电荷的离子吸引在其周围，形成一离子扩散层。加以电场时，颗粒向符号相反的电极移动即带阳电荷颗粒移向负极，带阴电荷颗粒移向正移;离子扩散层由于带有过剩的与颗粒符号相反的电荷，可以向相反方向移动。结果颗粒与离子扩散之间的静电引力使颗粒的泳动度减慢，另外，高分了颗粒表面有一层水，在电场影响下，它与颗粒一起移动，可以认为是颗粒的一部分。
2、 电场强度电场强度也称电位梯度，是指单位长度(每一厘米)支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用。例如纸电泳。测量25厘米长纸条两端电压为250伏特，则电场强度为250伏特/25厘米=10伏特/厘米。一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度大小，可将电泳分为常压电泳和高压电泳，前者的电压在100-500伏特，电场强度一般是2-10伏特/厘米;后者电压可高达500-1000伏特，电场强度在200-2000伏特/厘米。常压电泳分离时间需数小时至数天，高压电泳时间短，有时仅几分钟即可，高压电泳主要用于分离氨基酸，肽，核苷酸，由于电压升高，电压也随之增大，故需冷却装置。
3、 溶液的pH值溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少，对于蛋白质，氨基酸等两性电解质而言，溶液pH值离电点越远，颗粒所带净电荷越多;电泳速度越快;反之则越慢。例如血清中几种主要蛋白质的等电点各不相同，白蛋白等电点是4.0。α2球蛋白等电点是5.06，β球蛋白等电点是5.1，γ球蛋白等电点是7.1。当在pH8.6的电泳缓冲液中电泳时，这些蛋白质都带负电荷，它们的泳动速度是白蛋白< α2球蛋白>β球蛋白>γ球蛋白。因此，当要分离一种蛋白质混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的pH值，以利于各种蛋白质分子的解离。同时，为保持电泳过程中溶液pH恒定也须使用缓冲液。
4、 溶液的离子强度溶液的离子强度是另一个重要选择的条件，在保持足够缓冲能力前提下，离子强度要最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常缓冲液离子强度选择在之间。浓度大的缓冲液在合适电压下，有较低的电阻和较大的电流，产热较高。如果这种额外的热可以驱散，高浓度的缓冲液扩散常数较低，可以产生较窄细的电泳区带。离子强度很高时要用低电压，避免过多产热，这样又导致长的电泳时间，以致增加变性和区带分离困难。
5、 电渗作用在支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在电场中液体对固体支持物的相对移动，例如在pH8.6时，血清蛋白质进行纸电泳时， γ球蛋白与其他蛋白质一样带负电荷，应该向正极移动，然而它却向负极方向移动，这就是电渗作用的结果。滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷，如一束毛细管，进行电泳时蛋白质通过这些孔隙向前移动。纸的孔隙带有负电荷，与带电颗粒一样可以吸引正离子，因此介质沿管壁相对地带的较多的正电荷。在电场中，带负电荷的蛋白质向正极移动，而介质却向反向阴极移动，从而对蛋白质颗粒的泳动起阻碍作用。由于γ球蛋白分子颗粒大，净电荷较少，移动速度慢，电渗作用大于颗粒向前泳动的力，结果γ球蛋白向后退。而其他血清蛋白质，因分子较小，净电荷较多，电渗作用小于分子向前移动的力，因此分子向前移。所以，血清蛋白质电泳后球蛋白反而在点样位置之后。
SDS－PAGE电泳是实验室比较常用的一个实验，关于SDS－PAGE电泳的一些代表性问题，现集中整理一下以供大家参考指正。
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体（Acr）和少量的交联剂N，Nˊ-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）和加速剂（N， N，NˊNˊ-四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。前者电泳体系中缓冲液pH及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中的泳动主要靠电荷和分子筛效应；后者电泳体系中缓冲液离子成分、、凝胶浓度及电位梯度是不连续的，带电颗粒在电场中的泳动不仅主要靠电荷和分子筛效应，还有浓缩效应。PAGE所具有的分子筛效应、浓缩效应和电荷效应大大提高了蛋白的分辨率。
SDS－PAGE电泳的基本原理
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。具有机械性能好、化学性能稳定、灵敏度好、分辨率高的优点。PAGE应用十分广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量和少量制备，还可测定分子量和等电点等。
胶缓冲液系统的配制
在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。蛋白在浓缩胶浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；TEMED与AP加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
凝胶配制
根据凝胶配方和分离蛋白的需要配制聚丙烯酰胺凝胶。待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。
样品处理
根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。
1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。
2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。
3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
蛋白质染色
电泳后蛋白质染色目前常用的是考马斯亮蓝法，其比氨基黑染色法灵敏度高，可以进行定量扫描，比银染法简便。
常见问题及处理办法
1：出现拖尾现象
主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
2：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带
主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
处理办法：待其充分凝固再作后续实验。
3：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带
主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。
4：电泳的条带很粗
电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。
处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；为
5：“鬼带”，如何处理？
“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
6：电泳电压很高而电流却很低呢
这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。
处理办法：电泳槽正确装配即可。
7：出现纹理现象
主要是样品不溶性颗粒引起的。
处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。
8：溴酚蓝不能起到指示作用
我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。
处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。
9：浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡
A：这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
